顯微切割技術

一、顯微切割技術出現的背景
在分子病理學研究中，常常遇到兩個比較棘手的問題，一是選取的研究材料需要在某一方面具有相同的特徵，即具有一定程度的同質性，例如我們想通過蛋白質印蹟的方法定量研究淋巴組織中CD4陽性和CD8陽性細胞內某種信號傳導分子的表達水平，那麼我們首先就必需分別選取分離淋巴組織中CD4陽性和CD8陽性的同質細胞，再進行後續的蛋白提取與檢測，而我們人體的各種組織絕大多數是由多種不同細胞組成的異質性的細胞群，這種選取同質性的研究材料問題在對人體組織的深入研究中常常遇到卻又不易解決；二是隨著研究的不斷深入需要在組織細胞中分離的研究材料日趨微小，常規手段往往不易做到，例如要收集分離組織內的單個細胞或細胞內的特殊組分如核仁或包涵體或染色體的某一區帶等。顯微切割技術（microdissection technique）可以很好地解決以上問題,因而受到高度重視並得以廣泛應用，本文謹就此技術作一簡介。
二、什麼是顯微切割技術
1 ．定義
顯微切割技術是在顯微狀態或顯微鏡直視下通過顯微操作系統對欲選取的材料（組織 , 細胞群，細胞，細胞內組分或染色體區帶等）進行切割分離並收集用於後續研究的技術。顯微切割技術實際上屬於在微觀領域對研究材料的分離收集技術，因此應用此技術往往是許多要深入的研究工作中起始的重要一步。以下就顯微切割技術的特點、方式、材料、結合技術、影響因素和最新進展作簡要敘述。
2 ．顯微切割的特點
顯微切割技術的特點可以概括為以下四方面：一是 “ 細微 ” ，由於是在顯微狀態並採用特殊的分離收集手段，顯微切割的對象可以達到微米級，顯微切割的精度可以達到毫微米級，因此利用顯微切割技術可以分離收集到像核仁和包涵體及染色體特異區帶這樣細微的對象；二是 “ 原位 ” ，利用顯微切割技術是在組織細胞或染色體的原位取材，因此所取材料的定位清楚，所研究對象的歷史背景明確。例如何杰金氏淋巴瘤中瘤組織成分多樣 , 特徵性的瘤細胞 (RS 細胞及其變異型 ) 佔細胞成分的 2% 左右 , 且呈散在性分佈 , 如果常規地用組織勻漿的方式從組織中提取蛋白質或核酸，則既包含了來自瘤細胞的成分，又包含了來自淋巴細胞、漿細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、組織細胞等多種非瘤細胞的成分 , 這樣所提的蛋白質或核酸來自何種細胞並不清楚，而如果用顯微切割技術則可以選擇我們需要的細胞，以使研究對象的歷史背景明確；三是 “ 同質 ” ，顯微切割技術可以保證所取材料一定層次上的同質性，例如前面提到的它可以收集 CD4 或 CD8 陽性的同質細胞；四是 “ 結合 ” ，顯微切割技術可以與多種分子生物學、免疫學及病理學技術結合使用。正是由於顯微切割技術具有上述特點或者稱為優勢，其在分子病理學研究中的應用十分廣泛。
3 ．顯微切割的方式
顯微切割的歷史實際上可以追溯到本世紀六十年代。1965 年， Baxter TJ 就曾用顯微切割技術對腎小管進行了研究，但當時顯微切割的手段還比較落後，制約了其在醫學研究中的廣泛應用。隨著技術的不斷發展，顯微切割也出現了多種方式，依其發展的過程可以分為以下四種：手動直接顯微切割、機械輔助顯微切割、液壓控制顯微切割和激光捕獲顯微切割（ Laser Capture Microdissection ）。這些方式各具特色 , 不同實驗室可根據各自條件進行選擇 . 手動直接顯微切割是早期的切割方式，它是直接在顯微鏡下手持切割用針分離組織或細胞群，此種方式切割精度低，只適用於對較大塊組織中的局部區域或細胞群進行分離，切割單個細胞十分困難；機械輔助顯微切割是利用普通光學顯微鏡的微調旋鈕控制切割針切割細胞 , 可採用30G1/2 注射用針替代需要專用拉絲設備製作的玻璃切割針 , 此方式切割精度較手動直接顯微切割的精度有了提高，可以達到對較大的單個細胞的切割，而且此方式簡單易行低耗 , 尤其適合於基層和無專用設備的單位，但由於顯微鏡的微調旋鈕只能進行二微控制，對切割後的細胞進行收集較為困難，且切割精度仍然較低；液壓控制顯微切割是採用液壓式顯微操縱系統配合倒置顯微鏡進行顯微切割，目前常用的操縱系統有日本的 Narishige 和德國的 Eppendorf 液壓顯微操縱系統，該系統同時可用在轉基因動物及顯微注射等實驗中，它通過液壓系統可提供 X 軸、 Y 軸和 Z 軸三個方向的精確的三微控制，其切割精度是目前各種方式中最高的，也是很多實驗室常用的方法，其不足是不能實現顯微切割的自動化 , 要收集較大量的目的組分時耗時長，效率低；激光捕獲顯微切割是目前最為先進的方式 , 它快速方便 , 可從大量的研究材料中迅速捕獲較多的目的組分 , 自動化程度高 , 但這需要昂貴的專用設備。
4 ．顯微切割的材料
顯微切割的材料可以是以各種方式貼附於固相支持物上的各種組織細胞成分，其來源十分廣泛，石蠟組織切片、冰凍組織切片、細胞鋪片、細胞爬片、細胞甩片、培養細胞、常規製備的染色體等均可採用。具體選擇何種材料根據研究目的的不同進行，如果顯微切割後需要進行 RNA 分析則通常採用冰凍組織切片或新製備的細胞片；在回顧性研究中福爾馬林固定石蠟包埋的組織切片應用最為廣泛。
5 ．顯微切割的結合技術
顯微切割時究竟選擇什麼樣的細胞完全取決於研究的目的，但如何識別欲切割的細胞及如何對已切割的細胞進行分析，則需要和其它方法相結合。正是由於能與多種分子生物學、免疫學、遺傳學及病理學技術結合應用使顯微切割技術顯示出蓬勃的生命力。根據研究的需要可在顯微切割前應用組織化學、免疫組織化學、原位雜交、原位末端標記、原位 PCR 、 FISH 、組織特染等方法對需要切割的組織內成分進行標記，顯微切割後獲得的材料可以用於提取蛋白質、 DNA 和 RNA 等用於 Western Blot 、 Southern Blot 、 Northern Blot 、 PCR 等蛋白質和核酸的相關分析。
三、顯微切割的影響因素
由於顯微切割常常是與多種方法結合使用，影響顯微切割實驗最終結果的因素也就多種多樣。這就需要在實驗過程中把握一個原則 , 即一切與顯微切割結合的技術中影響因素應同時列為顯微切割實驗最終結果的影響因素，在實驗的過程中予以考慮。與不同的方法結合決定了需要對顯微切割的材料進行不同的處理，如顯微切割後需要進行 RNA 的相關分析，則所有過程必需確保無 RNA 酶的降解干擾 ; 如顯微切割後需要進行基因組 DNA 的相關分析 , 則應該保持基因組的相對完整性 , 避免在樣品處理過程中造成 DNA 的降解和斷裂 , 這就需要選擇合適的方法進行樣品的固定和保存 , 例如在福爾馬林固定石蠟包埋的組織中由於固定包埋劑的影響存在較多的 DNA 斷裂 , 而且隨著保存時間的延長 ,DNA 的斷裂越多 , 因此欲分析的 DNA 需要保持完整時 , 選擇石蠟切片進行顯微切割則不合適 ; 如果要對石蠟組織切片顯微切割後進行 PCR 分析 , 則設計引物時應注意使其決定擴增的片段長度不要太長 , 一般在保證特異性的前提下 , 最好選擇擴增片段長度 200bp 以下的引物。
運用顯微切割技術時應該分離多少細胞或亞細胞才能滿足實驗研究 ​​的需要 , 這要受多種因素的影響 . 例如單細胞顯微切割用於 DNA 分析所需的單個細胞數，依研究目的、標本固定方式、切片厚度、細胞大小、 DNA 提取方式、 PCR 擴增片段長度的不同而有差異。Dietmaier 等比較了用流式細胞儀分選細胞和用顯微切割從冰凍切片和石蠟切片上切割單個細胞用於突變分析所需的最少細胞數的差別，結果冰凍切片與流式細胞儀相同，至少需要 10 個細胞，而石蠟切片一般需要 30 個細胞。如果要分析切割細胞中病原微生物的 DNA 情況，則細胞內病原體的拷貝數越多，需要的細胞數越少。冰凍組織切片較石蠟組織切片更適宜於對細胞基因組 DNA 的分析。在不影響形態觀察的前提下，作為顯微切割的組織切片越厚越好，對於石蠟組織一般主張選用 7?m 的連續切片較為適宜。分析基因組 DNA 時，細胞越大，則需要切割更多的細胞，才能保證包含細胞的全部基因組。從顯微切割的細胞中提取 DNA 多采取直接法，即採用蛋白酶 K 消化後再加熱滅活酶的方法，這樣可以減少在提取過程中 DNA 的丟失。在採用激光捕獲顯微切割時或可以切割較多的細胞時，也可採用酚氯仿抽提的常規方法提取細胞 DNA 。由於如前所述的石蠟組織中存在 DNA 的斷裂，如果要對其切割的細胞進行 PCR 分析，則擴增的片段越長，需要切割的細胞數越多。
四、顯微切割的最新進展
顯微切割技術的進展主要體現在激光捕獲顯微切割技術的廣泛應用，此項顯微切割技術開創了細胞分離技術的新紀元。借助於這一革命性技術，我們可以快速地精確識別和特異分離單個或群體細胞用於進行下一步的細胞及分子生物學研究，其精確識別是在顯微鏡下通過細胞形態、免疫組織化學染色及組織化學染色等方法並有計算機輔助實現，而特異分離則是通過低能量紅外激光及專用的細胞轉移膜實現。激光捕獲顯微切割是通過激光顯微細胞分離系統實現的，該系統由倒置顯微鏡、紅外激光發射器、真空泵、細胞轉移膜及計算機組成。通過顯微鏡載物台中真空泵固定載玻片，通過附著在離心管蓋底的超薄細胞轉移膜將由紅外激光分離挑選出的細胞轉移到離心管中，並可以直接被離心管中的提取液所溶解和提取，其提取液的性質可以根據您所提取的細胞組分而自行決定，而且所有的細胞分離過程，無論是轉移操作還是保存樣品，都無需任何手工操作，可以實現無污染的細胞分離。目前的激光顯微細胞分離系統通常能夠提供三種規格的激光光束直徑，它們分別是小於 7.5µm 、 15µm 和 30µm ，小於 7.5µm 光束可 ​​以分離挑選單一細胞， 15µm 和 30µm 光束則可以分離挑選較大區域，從而可以保證系統具備較高的準確性和效率以實現對特定細胞或細胞亞群的分離挑選，分離前後及被捕獲的細胞圖像以統一的數據庫格式貯存於計算機中。
近年來，激光捕獲顯微切割技術在分子病理學研究中的應用不斷深入，特別是在腫瘤基因突變檢測、腫瘤特異基因表達分析、雜和性丟失檢測、微衛星序列不穩定性分析、新基因發現、核酸及蛋白質的定量研究、染色體畸變分析、細胞局部病變病因學研究等多種領域進行了廣泛應用，取得了許多本技術誕生前無法實現的新研究成果。