一般而言，對於蛋白質結構的測定，主要的科研方法包括 X 光衍射法、核磁共振譜法，以及傳統的單顆粒電子顯微鏡重構。但這些方法需要獲取成千上萬的結構全相同或不能落差過大的蛋白質分子信號或影像來完成，受蛋白質是否結晶、分子量過大或結構是否單一等條件製約，研究人員無法獲得任意單個蛋白質個體分子的 3D 結構，從而無法獲得蛋白質的結構關節信息，直接影響對與之密切相關的功能理解。任罡和張磊博士發展了一套測定任意單個蛋白質個體分子的 3D 結構方法，稱之為“Individual-Particle Electron Tomography （單個體蛋白電子顯微斷層成像技術，即IPET ）” 。這是一種利用電子顯微斷層成像技術有機地結合獨立開發的 3D 結構重構算法研究蛋白質個體分子結構的技術。該項技術的論文發表在2012 年1月24日出版的PLoS ONE 期刊，題目為《IPET and FETR: Experimental Approach for Studying Molecular Structure Dynamics by Cryo-Electron Tomography of a Single-Molecule Structure 》。
單個高密度脂蛋白分子的 3D 重構過程。(A) 從不同角度下拍下ApoA-1影像，再以 ApoA-1 開始利用電腦增強（預測）明確的信號，將不同角度的影像進行重建 3D 影像，以及最終結果的側面圖；(B) 最終 3D 重構結果的放大影像；(C) 分析表明粒子形成的結構是由三個ApoA-1蛋白（紅，綠，藍的像麵條模型）。（DEF）另一個高密度脂蛋白的 3D 結構重構過程。
對單個蛋白結構的確定，使得人們可以通過觀察同一種蛋白質的不同形態，得到該種蛋白在自然狀態下的動態關節；更使得人類研究生物大分子的活性以及結構-功能關係成為可能。為證實這一可能，任罡和張磊博士對兩個IgG 抗體的 3D 結構進行了比較，並利用影片進行了演示，此影片顯示了抗體一號的三個分子如何動態地變化到抗體二號的狀態。
“這好比打開了一道門，一道通往研究蛋白動態性的大門，”任罡博士說，“ IPET 算法的發表，以及我們正在著手準備的一系列IPET 應用的文章，無疑將標誌著電子顯微鏡在生物大分子動態形態結構研究領域的一場革命的開始。一個新時代即將被開啟！”
該論文詳細描述了 IPET 的流程細節和重構算法具體步驟，陳述了可以突破電子斷層成像方法重構的分辨率極限理論證據，並分析了各種實驗誤差影響和探討了傳統算法的局限性及其對 3D 重構分辨率的影響，從而證明了傳統所認為的“單個蛋白分子信號不足以重構有結構意義的 3D 空間密度圖”這一觀點的片面性。為了證明該方法對真實實驗影像處理的實用性，任罡和張磊博士在實驗中對兩種蛋白質的四個單獨的個體分子進行了迄今為止最高分辨率的 3D 結構測定。該研究成果被多名專家評價為具有開拓性的方法論，而論文的發表對蛋白個體分子的 3D 結構測定和蛋白質動態結構的研究具有里程碑式的意義。
任罡博士自 1990 年開始師從中國著名的理論物理學家"段一士教授"於蘭州大學物理系攻讀碩士學位，自1993 年師從中國著名的高分辨電子顯微學創始人、準晶體的獨立發現人之一的"郭可信院士"於北京科技大學材料物理系攻讀博士學位。攻讀博士學位期間，任罡博士同時跟隨從英國劍橋大學留學歸國的彭練矛教授（北大教授、國際電子晶體學學會會長）從事博士論文及相關的科研工作。此期間的學習和獲得的培訓使任罡博士具備了堅實的高分辨電子顯微學理論基礎和實驗技巧。1997 年任罡博士赴美，在美國加州聖地亞哥Scripps 研究所細胞生物學系的 Alok Mitra 研究小組從事AQP1 水通道膜蛋白的電子晶體學博士後研究；在2001 年初測定了該水通道膜蛋白的原子結構，該項研究對2003 年獲諾貝爾化學獎的研究工作給予了有力支持，引起轟動，並被科學時報等新聞媒體廣泛報導。
2006 年任罡博士在美國加州大學舊金山分校成立了自己的獨立研究小組，主攻人體脂蛋白結構的冷凍電子顯微鏡研究。在此期間，他曾利用單顆粒平均方法獲取了低密度脂蛋白的 3D 結構，該成果引起了業內廣泛關注，相關的論文被發表於2010 年的PNAS 期刊。自2008 年底張磊博士的加入開始，任罡博士科研小組將研究方向轉向了單個蛋白質個體分子的 3D 重構方法論，力圖攻克高動態性蛋白的結構研究瓶頸。任罡和張磊博士憑藉出色的電子顯微鏡操作技術、堅實的物理學背景、嫻熟的數學技巧和電腦編程能力，以及夜以繼日的勤奮工作，使研究取得了突破性的進展。不僅首次從實驗中獲得了分子量極低（小於200 kDa ）、尺寸極小（小於20 nm ）的人體高密度脂蛋白的冷凍電子顯微斷層影像；而且利用自主開發的電腦軟體演算法，極大地降低了影像的噪點及不穩定性，在人類對蛋白質研究歷史上，首次獲得了單個分子的高分辨的 3D 重構圖。
與光波波長相比，電子的波長更短，使得利用電子成像的透射電子顯微鏡可以觀察到原子水平的物質細節。任罡博士科研小組主要利用冷凍電子顯微鏡技術，在零下180 度左右的低溫下製備並檢測樣品。在此溫度下，液態樣品會被快速冷凍到非晶態冰狀態，樣品最終被固定在直徑約 3mm 的金屬網上非晶碳膜的孔洞中，然後被快速放置於電子顯微鏡真空腔內。斷層掃描像是通過傾轉（如從+70 °到-70 °，以1 °間隔傾轉）取得整個樣品。由於蛋白質的尺寸極小，為了保證成像區域在整個過程中不會偏離，電鏡的各種參數必須進行精確的調製。“這就好比將要轉動的樣品載體放大到整個地球一樣的大小，你要跟踪觀察的蛋白的尺寸就如地球上的一個戒指大小，而照相的過程就像在操作整個地球的轉動，必須保證地球上的這個戒指大小的物體始終保持在觀察視野的中心。”任罡博士如是說。在成像過程中，機械的震動、環境的噪音、溫度的變化，甚至包括冷凍槽中維持低溫用的液氮中的氣泡的震動，都要被最大限度地降低，將其引起的機械誤差控制在一個微米的範圍內才有可能得到一套完整的數據。
液氮低溫不僅可以使蛋白樣品被固定在非晶態冰中保持其在自然中的結構狀態，還可以使樣品在低電子輻照下更好地成像，從而保證蛋白在大約1-2 個小時的傾轉成像過程中完好無損。
背景：勞倫斯伯克利國家實驗室毗鄰於美國著名的加州大學伯克利分校，隸屬於美國國家能源部，是一所擁有十三位諾貝爾獎得主、五十七名美國科學院院士、四千兩百多名科研人員的國家級科研機構。該實驗室與業內研究機構相互合作、人員儀器交流廣泛。
沒有留言:
張貼留言