摘要】細胞凋亡研究對現代醫學產生了巨大推動作用，並已成為當前生命科學和醫學領域的研究熱點，因而熟悉細胞凋亡的調控機制和合理選擇檢測方法顯得尤為重要。本文就近年來GraB 、eIF4E 、ced-13 、Survivin 等細胞凋亡調控基因和凋亡的檢測技術加以綜述。
【關鍵詞】脫噬作用; 基因表達調控
Progress on gene regulation and detecting of apoptosis
LIU Le-bin ，CAO Jia.
Department of Hy-giene Toxicology ，Faculty of Preventive Medicine ，Third Military Medical University ，Chongqing 400038 ，China
【Abstract 】Studying on apoptosis has improved modern medicine development ，and many researches have been focused on it.It's very important for researchers to magulation mechanism of apop-tosis and to select the best test methods.This paper reviews the advances of regulation gene of apopto-sis———GraB ，eIF4Em ，ced-13 ，Survivin and detecting methods.
【Key words 】Apoptosis;Gene expression regulation （Chin J Dis Control Prev2005 ，9 （5 ）:458-461 ）
細胞凋亡是由基因控制的細胞主動死亡過程，它直接參與機體的許多生理和病理活動，具有重要的生物學意義。細胞凋亡研究給現代醫學帶來巨大推動作用，許多以分子靶向治療為手段的抗癌新藥的發現，更是以細胞凋亡理論為奠基石。隨著現代科學技術的不斷創新和運用，細胞凋亡的內在調控機制也不斷為人們所認知，但由於其發生機制非常複雜，目前檢測手段還不夠精確，所以熟悉當今細胞凋亡調控機制的最新進展和合理選擇檢測方法顯得尤為重要。本文就近年來有關細胞凋亡調控和檢測等方面的研究進展綜述如下。
1 細胞凋亡的調控
1.1 GraB 介導凋亡
顆粒酶B （granzyme B ，GraB ）是殺傷性淋巴細胞內殺傷顆粒特有的絲氨酸蛋白酶，其化學性質和其他絲氨酸蛋白酶相似，但它對底物的選擇與糜蛋白酶更接近，是細胞介導的細胞毒作用中最主要的效應分子，是殺傷細胞的標誌性分子之一［1 ］。
GraB 分子最初以酶原的形式合成。GraB 進入細胞後以何種信號轉導通路誘導細胞凋亡說法不一。最初認為顆粒酶不能單獨進入靶細胞內，必須經穿孔蛋白在靶細胞打孔後才能進入，並激活膜上的蛋白酶ICE/ced3 而引發凋亡。最近研究顯示，GraB 進入靶細胞可能不依賴穿孔蛋白形成的膜通道，例如: 在穿孔蛋白剛足以與GraB 協同誘導靶細胞凋亡的濃度下，孔道形成數量不夠; 穿孔蛋白形成膜孔道太小而無法讓30ku 的GraB 通過; 缺失穿孔蛋白時，GraB 仍可進入靶細胞［2 ］。
現有資料顯示GraB 可以在細胞質、線粒體和細胞核3 個層次作用於不同的分子誘導細胞凋亡，主要機制有: ① 激活caspase; ② 激活BH3-only 蛋白; ③ 裂解細胞重要蛋白 ［3 ］。最早發現它能激活cas-pase3 而使細胞走向凋亡。體外實驗［4 ］還證明GraB 裂解激活了大量的caspase 家族成員（如caspase-6 、caspase-7 、caspase-8 、caspase-9 、caspase-10 ），從而通過蛋白酶在體內激活多個家族成員而引發凋亡。但用caspase 抑製劑阻斷caspase 通路後，GraB 仍能使細胞裂解。在線粒體中心途徑，GraB 通過裂解BH3-only 蛋白和凋亡前的bcl-2 家族成員啟動凋亡［5 ］。Sutton 等［6 ］研究發現GraB 可以直接酶解Bid 和Bax 等，啟動細胞色素C 的釋放，而且這種途徑不需激活caspase 。Trapani 等［7 ］研究提示，GraB 在cas-pase 通路被抑制後，能作用於細胞核內的DNA 斷裂因子45 （DNA fragmentation factor45 ，DFF45 ），從而降解基因組DNA 。GraB 除在胞漿中激活caspase 級聯反應啟動凋亡外，還可直接遷移至細胞核，切割核有絲分裂元件（nuclear mitotic apparatus ，NuMA ）和多聚ADP- 核糖聚合酶（poly ADP-ribose poly-merase ，PARP ）等一系列核蛋白，啟動或促進核凋亡。GraB 對核內物質具有親和力，體外試驗除去核膜的細胞核中可觀察到大量GraB 聚積 ［8 ］。
1.2 eIF4E 介導凋亡
真核啟動因子4EeIF4E 為25kD 多肽，作為游離多肽或翻譯啟動因子復合體eIF4E 的一部分可以特異地與mRNA5' 帽子結構結合［9 ］。eIF4F作用是使mRNA 結合到43S 啟動複合體上，使mRNA5' 非翻譯區的二級結構鬆動，在翻譯起始位點的暴露、定位中起關鍵作用。eIF4E 基因是新近發現的原癌基因，它是帽子依賴翻譯機制的關鍵性元件。一般認為eIF4E 通過增強某些生長因子或重要的細胞生長調節因子的翻譯而發揮作用，是調節翻譯速度的關鍵因素，在eIF4E 家族成員處於最重要的位置。eIF4E 低表達時，“ 弱的mRNAs” 不能與有限的eIF4E 結合，導致低表達; 當eIF4E 高表達時，可使“ 弱的mRNAs” 表達進一步增加，使細胞生長加速，並產生形態上的改變，甚至導致細胞癌變［10 ］。在帽子依賴翻譯中，eIF4E 的作用被eIF4E 結合蛋白阻滯，如4E-BP1 ，後者通過磷酸化作用而阻止凋亡［9 ］。
1.3 ced-13 基因介導凋亡
目前研究較多的是ced-9 、ced-3 和ced-4 。ced-9 與人的bcl-2 基因有同源性，其作用是抑制細胞凋亡。ced-3 和ced-4 則啟動細胞凋亡，前者編碼一種與半胱氨酸蛋白酶家族同源的蛋白質，能在哺乳動物中啟動凋亡; 後者可與細胞色素C 結合，使caspase- 3 活化。近來Schu-macher ［11 ］描述線蟲中ced-13 編碼BH3 （bcl-2ho-mology3 ）-only 蛋白，結果發現DNA 損傷後ced-13mRNA 積聚，這種聚集依賴於一個完整線蟲的cep-1/p53 基因。ced-13 蛋白與bcl-2 相互影響。體細胞ced-13 過度表達導致正常存活的細胞死亡，這種死亡需要線蟲的核心凋亡路徑。近年研究提示在哺乳動物p53 誘導的凋亡中有兩種BH3-only 蛋白p53 凋亡上調蛋白（p53upregulated modulator of apopto-sis ，PUMA ）和多聚ADP- 核糖聚合酶Noxa 。實驗表明除BH3-only 蛋白EGL-1 之外，ced-13 可能作為對p53 活化後的反應而促進線蟲的凋亡。
1.4 Survivin 基因抑制凋亡
Survivin 是近來發現的一種抗凋亡基因，是至今發現的最強的凋亡抑制因子，它由約1.5×10 3 個鹼基對組成所編碼，有4 個外顯子和3 個內含子，分子量16.5kD 。Survivin 在溶液裡是一個穩定的同型二聚體。單一複制的Survivin 基因在人類定位在染色體17q25 ，在小鼠定位在染色體11e2 ，它是哺乳動物IAP 基因家族中最小的成員［12 ］，主要表達於胚胎和發育的胎兒組織，終末分化的成人組織不表達（胸腺和生殖腺除外），但在惡性腫瘤中表達增高。Survivin 過度表達與經過內外凋亡路徑的細胞死亡抑制啟動有關13 ］。Survivin 反義基因表達導致體內凋亡抑制［14 ］，Sur-vivin 分子對抗劑包括反義核酸、核酶和siRNA 序列caspase 依賴的細胞死亡，可增加體內凋亡刺激和抗癌活性［15 ］。
Survivin 抑制凋亡的概念儘管已經確立，但這種現象產生的機制還未完全闡明。體內在Survivin 和其上游線粒體的啟動者caspase-9 已被證實［16 ］。有實驗發現Survivin 與Smac/DIABLO 有關［17 ］，一種由線粒體釋放的凋亡基因減少了IAPs 抑製作用對caspase 活性的影響。研究表明Survivin 不同於其他IAPs 或者caspases 效應器，可能是選擇性的瞄準線粒體途徑的caspase-9 活化，這一點在紫杉醇誘導凋亡的體內外實驗中得到證實［18 ］。
2 細胞凋亡檢測方法
2.1 凋亡事件順序
Suzuki 等 ［19 ］ 在研究心肌細胞的凋亡時建立了事件順序表。他們用H 2 O 2 誘導凋亡2h 後，第一個現象為微粒體甘油三酯轉移蛋白丟失，同時caspase-3 活性啟動。4h 後Annexin V 反應陽性，磷脂酰絲氨酸外翻。在MTP 丟失和cas-pase 激活持續的情況下，9h 後Bax 表達、DNA 片斷化出現。14h 後用Tunel 法可以在電鏡下看到核的凋亡特徵。因此核凋亡事件的時間順序在凋亡鏈中很清晰，DNA 完全片斷化需要長時間特徵才明顯。由於試驗是在體外和理想模型下完成，因而在動物活體和人體上凋亡鍊是否以規則持續的速度或者以一種方式演變還無法確知，DNA 片斷能在核內存在多長時間仍不可知。因此在不同時間計數細胞可能出現過高估計細胞凋亡率的現象。
2.2 鑑定細胞凋亡的方法
鑑定凋亡細胞的金標準是染色體濃縮的超微結構和形態特徵。儘管電鏡是最好的參數，但由於使用電鏡的勞動量大、價格貴而不被列入常規實驗工作，常選擇其他多項凋亡檢測方法。每種方法均有其局限性，必須結合兩種或更多的方法以避免誤差［20 ］。
細胞發生凋亡後，出現多個生物學特徵改變，如細胞膜結構變化、染色質凝集、核DNA 斷裂等。目前DNA 斷裂檢測是一種廣為認可的檢測凋亡的方法，由於缺乏定位特徵，在病理形態學中價值不大，但在群體細胞凋亡分析時仍有一定的意義。Tunel 法是使用最廣泛的技術。如標記後的樣品與相應的酶聯抗體作用後，可催化底物產生顏色反應，然後在普通顯微鏡下觀察; 樣品被熒光素標記可直接在熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡下觀察或採用流式細胞儀檢測［20 ］。Tunel 實驗可以在培養細胞、石蠟包埋或冰凍切片上進行，具有較好的定位作用。但Tunel 法應注意如下問題: 壞死細胞也有DNA 斷裂形成，Tunel 反應亦呈陽性; 細胞代謝中亦有DNA 重組、修復和有絲分裂; 實驗過程中的人為因素如樣本固定、蛋白酶預處理等均可造成假陽性，因此凋亡細胞計數結果會偏高。Tunel 法是建立在DNA 片斷化基礎上的方法，要多少DNA 斷裂成180 ～200bp 的核小體，才能有典型的凋亡細胞出現還需要探索。
流式細胞分析術（flow cytometry ，FCM ）以其可定量分析、可同時進行多參數檢測，及具有較高的敏感度等優點，近年來受到許多研究領域的關注和運用。FCM 主要根據細胞凋亡時在細胞、亞細胞和分子水平上所發生的特徵性改變，包括細胞核的改變、細胞器的改變、細胞膜結構的改變和細胞形態的改變等。用FCM 檢測細胞時，必須用熒光染料對細胞進行染色，並要求細胞呈懸浮狀態。凋亡細胞形態學上的改變影響它們的光散射特徵（前向散射光和側向散射光），根據這一特性用FCM 進行形態學分析時可以與免疫熒光技術相結合測定凋亡細胞的表型。但是前向散射光的下降並非凋亡細胞的特異性標誌，細胞的機械性損傷、細胞壞死時，其前向散射光也會下降。需要指出的是前向散射光的降低和側向散射光的增加出現在凋亡的最早期，然後前向散射光和側向散射光均降低。這種方法對樣品收集、處理（特別是固定）和製備等過程有極高的要求，適用於細胞群集性好的體外細胞系，尤其是經過亞克隆培養的細胞系凋亡的檢測。應用FCM 進行DNA 含量分析檢測凋亡細胞具有快速、定量的優點，並可作多參數分析。在獲得凋亡細胞百分數的同時，對細胞週期中各時相分佈的變化進行相關比較，但凋亡峰的形成受到細胞碎片的干擾，定性困難。運用多種方法對凋亡分析時發現，當凋亡主要發生在G2 期、M 期或S 期時，易造成S 期、G0 期或G1 期增加（或阻滯）的假象，此時並無凋亡峰。因此這種方法適用於凋亡早期各期細胞DNA 平行斷裂、DNA 含量一致減少的情況。Annexin V 是一種磷脂結合蛋白，與PS 有高度親和力。細胞凋亡早期，膜PS 由脂膜內側翻向外側，它發生在細胞核變 化之前，用異硫氰酸熒光素標記Annexin V ，同時結合使用碘化丙啶拒染法，檢測細胞膜的完整性。凋亡細胞對PI 有拒染性，而壞死細胞則不能。因此依據PS 的變化和膜對PI 的拒染性可以應用FCM 進行檢測，即Annexin V FITC 和PI 雙染色法。此雙熒光染色法檢測的細胞不需固定，但細胞膜的改變持續時間較短，檢測時機選擇非常重要。同時貼壁生長的細胞製做細胞懸液時，需正確運用消化方法和掌握最佳時機。
ELISA 法檢測凋亡細胞DNA 降解時，採用抗體夾心法。首先用抗組蛋白抗體包被酶標測定板，接著用封閉試劑封閉，加入含核小體和寡聚核小體的凋亡細胞裂解物，核小體即可與抗組蛋白抗體結合。最後，加入過氧化物酶標記的抗DNA 抗體，可與已固定在酶標板上的核小體或寡聚核小體中DNA 結合，在過氧化物酶底物存在時，產生顏色反應，通過酶標分析，即可定量測定凋亡細胞。ELISA 法可以測得這種複合體，作為凋亡尤其是早期凋亡的指標，該法敏感性高，可測500 個/ml 凋亡細胞，不需特殊儀器，但不能精確測定凋亡發生絕對量。
Heochst 類染料可以少量通過正常細胞的細胞膜而細胞毒作用較少，可利用該染料對典型凋亡細胞的胞核結構染色，如Hoechst33342 、DAPI 、YOPRO-1 等。但由於其特異性低，應用時應結合其他方法，評價時需謹慎［20 ］。
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