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2013年1月28日 星期一

如何選擇你所需求的共軛焦顯微鏡


共軛焦顯微鏡比寬場顯微鏡具有更多的優勢,共軛焦顯微鏡可以對樣品做連續光學切片並排除非焦平面的信號干擾,為此共軛焦顯微鏡的應用也的確更為普遍。不過市面上各種各樣的共軛焦顯微鏡越來越多,要如何進行選擇呢?
在選擇共軛焦顯微鏡時,最基本也最重要的考慮因素主要有兩點:
您想要研究的樣本類型(如:固定的細胞還是活細胞),以及您想要進行的檢測類型(如:靜態還是動態細胞過程)。固定細胞的共軛焦成像要對固定且染色了的細胞或組織成像,我們一般選擇雷射掃描共軛焦(LSCM)。
這主要是因為固定的死細胞缺乏活細胞中的快速生物學事件,能更好的受益於LSCM較高的空間分辨率。LSCM成像是通過雷射對樣品進行光學層切,掃描速度(取決於掃描陣鏡速度)一般為1fps。曝光時間越長意味著光漂白的風險越大,但對於固定的死細胞,時間並不是很關鍵,我們可以通過拍多張圖片來平均。
活細胞的共軛焦成像成像活細胞需要額外的保護,以免不友好環境的干擾。在成像時,我們首先需要考慮的是保持細胞的活性和健康,恆溫加熱元件和灌流系統是必不可少的,尤其對於進行time-lapse(時間序列)的研究來說。控制活細胞生理狀態的快速生化事件是大多數人最想要研究的,但這些事件對於傳統LSCM來說太快了。此外,LSCM的長時間曝光還會引發毒性光照損傷細胞。
因此,對活細胞進行成像會需要特殊的共軛焦顯微鏡。對活細胞進行共軛焦成像一般有兩個選擇:快速掃描的雷射掃描共軛焦和轉盤共軛焦。
快速掃描共軛焦顯微鏡用較快的共振掃描陣鏡(resonant scanning mirrors)取代較慢的galvanometers mirrors,能使掃描速度達到30fps;而轉盤共軛焦(SDCMs)的優勢在於掃描速度更快(雖然不可避免的要損失空間分辨率),其速度理論上可達到2000fps(實際上往往受到其他因素的限制)。如果您擔心光漂白或者很弱的螢光信號,那麼SDCM可能更加適合。SDCM採用兩個帶有陣列微孔的轉盤轉動來分散激發光 ​​,不同於LSCM對樣品進行點掃描,SDCM一次採集多個點(大約100個像素點),因而速度大大增加,並且SDCM的光漂白及光毒性更小。
不過,您也可以採用快速掃描共軛焦來提高掃描速度,配合高靈敏檢測器,降低激發光 ​​能量來減少光毒性,這樣能夠保證傳統共軛焦的豐富功能。自動化共軛焦成像系統一些研究者喜歡想方設法對顯微鏡進行改造,以適應自己的個性化需求。而有些研究者則對顯微鏡到底是如何工作的根本不敢興趣。對於後者而言,一台自動化的共軛焦顯微鏡可能更合他們胃口。


舉例來說,Olympus FluoView FV10i就是這樣一台全自動桌面型4雷射共軛焦顯微鏡,其緊湊的整合結構對安裝空間基本沒有要求。這類儀器非常適合那些需要每天做很多影像數據收集的研究者,當然它們並不能完全體現傳統共軛焦的功能及靈活擴展性。


此外,Nikon A1也是一套全自動共軛焦系統。與大多數傳統共軛焦掃描顯微鏡一樣,Nikon A1採用galvanometer掃描頭,其分辨率比採用混合式掃描頭的A1R高,但速度稍遜(A1R約30fps)。增加對各種共軛焦顯微鏡類型的了解,可以幫您找到最適用的儀器。如今,即使不考慮全自動系統,不論您選擇什麼機型,大多數係統都內置有豐富的人性化功能,可以使您收益匪淺。

現在,共軛焦顯微鏡正不斷向更快速、更靈敏、更高分辨率及更好的可擴展性發展,不斷有新技術誕生。速度方面,有共振快速掃描頭及轉盤共軛焦;靈敏度方面有AOBS分光系統及更靈敏的檢測器(HyD,GaAsp PMT);分辨率方面有超高分辨率(SIM,STED, PALM,STORM);此外還有多光子、白激光、SMD等技術。我們在選擇共軛焦系統時最好能多聽聽各廠家的介紹,以便對這些技術有所了解,根據自己可能進行的研究選擇最合適的儀器。

2012年3月8日 星期四

何謂雷射掃描共軛焦顯微鏡(Laser Scanning Confocal Microscopy ,簡稱LSCM)

還記得去年清大"江安世"教授利用共軛焦顯微鏡建構出果蠅「腦內嗅覺神經網路地圖」,今天小編就簡易的寫一篇何謂雷射掃描共軛焦顯微鏡(Laser Scanning Confocal Microscopy ,簡稱LSCM)


雷射掃描共軛焦顯微鏡(Laser Scanning Confocal Microscopy ,簡稱LSCM)是近代生物醫學影像儀器的最重要發展之一,它是在螢光顯微雷射掃描裝置,使用紫外光或可見光激發螢光探針,利用電腦進行影像處理,從而得到細胞或組織內部微細結構的螢光影像,以及在亞細胞水平上觀察諸如Ca2+、pH值、膜電位等生理信號及細胞形態的變化。已廣泛應用於細胞生物學、生理學...,有時也被稱為雷射掃描細胞儀(Laser Scanning Cytometer,LSC)是八十年代迅速發展起來的用於分析細胞學的新型儀器。LSCM與普通光學顯微鏡相比優點明顯,分辨率、靈敏度、放大率和螢光檢測信噪比大大提高。對活細胞可以做分層掃描後,進行3D重建和測量分析,對細胞內微細結構的動態變化...

雷射掃描共軛焦顯微鏡的發展
科學研究工作對更高影像分辨率的追求產生了雷射掃描共軛焦顯微鏡。隨著免疫螢光技術在生物學研究領域的廣泛應用,研究人員注意到,螢光顯微顯微鏡使用場光源,因標本鄰近結構(細胞或亞細胞結構)產生的衍射光和散射光的干擾,使標本中細微結構的成像不夠清晰。

一. 組成
倒置或正立螢光顯微鏡、掃描頭(照明針孔、探測針孔、螢光濾片系統、鏡掃描系統和光電倍增管)、掃描頭控制電路、電腦和影像輸出設備

二. 原理
利用放置在光源後的照明針孔和放置在檢測器前的探測針孔實現點照明和點探測,來自光源的光通過照明針孔發射出的光聚焦在樣品焦平面的某個點上,該點所發射的螢光成像在探測針孔上,該點以外的任何發射光均被探測針孔阻擋。照明針孔與探測針孔對被照射點或被探測點來說是共軛的,因此被探測點即共焦點,被探測點所在的平面即共焦平面。電腦以像點的方式將被探測點顯示在電腦螢幕上,為了產生一幅完整的影像,由光路中的掃描系統在樣品焦平面上掃描,從而產生一幅完整的共焦影像。只要載物台沿著Z軸上下移動,將樣品新的一個層面移動到共焦平面上,樣品的新層面又成像在顯示器上,隨著Z軸的不斷移動,就可得到樣品不同層面連續的光切影像。

在共軛焦顯微鏡的價格都是幾百萬台幣以上,因為非常精密所以價格不斐。
前一陣子工研院光電所已經有做出一台簡易式的共軛焦顯微鏡,小編已經測試過囉!當然精密度無法像正常一樣,但用來教學或用於較大型的物體還可堪用,售價小編記得大約在五十萬左右吧!

2011年11月2日 星期三

雷射掃描共軛焦顯微鏡的原理


一、雷射掃描共軛焦顯微鏡的原理

   傳統的光學顯微鏡使用的是場光源,標本上每一點的圖像都會受到鄰近點的衍射或散射光的干擾;雷射掃描共軛焦顯微鏡(Laser Scanning Confocal MicroscopeLSCM) 採用點光源照射樣本,在焦平面上形成一個輪廓分明的小的光點,該點被照射後發出的熒光被物鏡蒐集,並沿原照射光路回送到由雙色鏡構成的分光器。分光器將熒光直接送到探測器。光源和探測器前方都各有一個針孔,分別稱為照明針孔和探測針孔。照明針孔與探測針孔相對於物鏡焦平面是共軛的,焦平面上的點同時聚焦於照明針孔和發射針孔,焦平面以外的點被擋在探測針孔之外不能成像,這樣得到的共聚焦圖像是標本的光學切面,避免了非焦平面上雜散光線的干擾,克服了普通顯微鏡圖像模糊的缺點,因此能得到整個焦平面上清晰的共聚焦圖像。
                     原理圖


二、雷射掃描共軛焦顯微鏡組成特點

   LSCM 由顯微鏡光學系統,激光光源,掃描裝置和檢測系統構成,整套儀器由電腦控制,各部件之間的操作切換都可在電腦操作平台界面中方便靈活地進行。顯微鏡是LSCM 的主要組件,它關係到系統的成像質量。通常有倒置和正置兩種形式,前者在切片、活細胞檢測等生物醫學應用中使用更廣泛。

三、雷射掃描共軛焦顯微鏡的應用

一)細胞的三維重建


    普通熒光顯微鏡分辨率低,顯示的圖像結構為多層面的圖像疊加,結構不夠清晰。LSCM 能以0.1μm 的步距沿軸向對細胞進行分層掃描,得到一組光學切片,經A/D 轉換後作為二維數組貯存。這些數組通過計算機進行不同的三維重建算法,可作單色或雙色圖像處理,組合成細胞真實的三維結構。旋轉不同角度可觀察各側面的表面形態,也可從不同的斷面觀察細胞內部結構,測量細胞的長寬高、體積和斷層面積等形態學參數。通過模擬熒光處理算法,可以產生在不同照明角度形成的陰影效果,突出立體感。通過角度旋轉和細胞位置變化可產生三維動畫效果。LSCM 的三維重建廣泛用於各類細胞骨架和形態學分析、染色體分析、細胞程序化死亡的觀察、細胞內細胞質和細胞器的結構變化的分析和探測等方面。

二)靜態結構檢測:原位鑑定細胞或組織內生物大分子、觀察細胞及亞細胞形態結構
1. 細胞原位檢測核酸
用於細胞核定位及其形態學觀察、檢測細胞內DNA 的複制及斷裂情況以及染色體定位觀察。
2. 原位檢測蛋白質、抗體及其他分子
    原位檢測蛋白質、抗體及其他分子
    免疫熒光標記技術
    檢測熒光蛋白
3. 檢測細胞凋亡
檢測細胞凋亡不同時期細胞形態、細胞凋亡相關蛋白
4. 細胞器觀察及測定
探針可以直接跨過死細胞或活細胞膜,選擇性地與特定細胞器結合
5. 檢測細胞融合
觀察細胞骨架結構





 7. 觀察細胞間縫隙連接通訊
8. 檢測細胞內脂肪
 尼羅紅檢測動物組織中或體外培養細胞內脂滴含量

三)動態觀察:活體細胞或組織功能的實時動態檢測
1. 實時定量測定細胞內鈣的變化
鈣離子濃度測定和比率成像
2. 測定細胞內PH 變化
同一種探針BCECF ,分別用不同激發峰激發得到的熒光比例,探究PH 變化
3. 檢測膜電位的變化
JC-1 低電位下單體存在,發綠色熒光;高電位下J- 聚集體,發紅色熒光,隨電位增加,紅色熒光也增加
4. 檢測細胞內活性氧物種的產生
5. 藥物篩選
v        檢測藥物等跨膜進入組織或細胞過程及定位
v         對藥物、病毒、細菌等熒光標記,檢測是否進入、位置含量、動態過程
6. 檢測熒光共振能量轉移-FRET
GFP YFP BFP GFP 等研究大分子間的相互作用
.囊泡運輸研究
    利用胞吞胞吐探針FM4-64 ,結合激光共聚焦、電鏡、TIRF ,檢測囊泡的運動過程,探討BFA 對胞吞胞吐過程的影響。
8. 檢測熒光漂白恢復
將待測細胞用熒光物質標記,淬滅;低強度激光掃描成箱,非淬滅分子移動,直接反映熒光標記物質及其結合物的運動,因此可用來研究縫隙連接通訊的快慢.

綜上所述,雷射掃描共軛顯微鏡由於其高分辨率、高靈敏度、高放大率等特點,在細胞水平上可作多種功能測量和分析,成為分析細胞學的一項重要研究手段。隨著LSCM 設備和應用技術的不斷完善,它在生物醫學和生命科學領域裡將起到更重要的作用。