雷射掃描共軛焦顯微鏡的原理

一、雷射掃描共軛焦顯微鏡的原理

   傳統的光學顯微鏡使用的是場光源，標本上每一點的圖像都會受到鄰近點的衍射或散射光的干擾；雷射掃描共軛焦顯微鏡(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM) 採用點光源照射樣本，在焦平面上形成一個輪廓分明的小的光點，該點被照射後發出的熒光被物鏡蒐集，並沿原照射光路回送到由雙色鏡構成的分光器。分光器將熒光直接送到探測器。光源和探測器前方都各有一個針孔，分別稱為照明針孔和探測針孔。照明針孔與探測針孔相對於物鏡焦平面是共軛的，焦平面上的點同時聚焦於照明針孔和發射針孔，焦平面以外的點被擋在探測針孔之外不能成像，這樣得到的共聚焦圖像是標本的光學切面，避免了非焦平面上雜散光線的干擾，克服了普通顯微鏡圖像模糊的缺點，因此能得到整個焦平面上清晰的共聚焦圖像。

                     原理圖

二、雷射掃描共軛焦顯微鏡組成特點

   LSCM 由顯微鏡光學系統，激光光源，掃描裝置和檢測系統構成，整套儀器由電腦控制，各部件之間的操作切換都可在電腦操作平台界面中方便靈活地進行。顯微鏡是LSCM 的主要組件，它關係到系統的成像質量。通常有倒置和正置兩種形式，前者在切片、活細胞檢測等生物醫學應用中使用更廣泛。

三、雷射掃描共軛焦顯微鏡的應用

一）細胞的三維重建

    普通熒光顯微鏡分辨率低，顯示的圖像結構為多層面的圖像疊加，結構不夠清晰。LSCM 能以0.1μm 的步距沿軸向對細胞進行分層掃描，得到一組光學切片，經A/D 轉換後作為二維數組貯存。這些數組通過計算機進行不同的三維重建算法，可作單色或雙色圖像處理，組合成細胞真實的三維結構。旋轉不同角度可觀察各側面的表面形態，也可從不同的斷面觀察細胞內部結構，測量細胞的長寬高、體積和斷層面積等形態學參數。通過模擬熒光處理算法，可以產生在不同照明角度形成的陰影效果，突出立體感。通過角度旋轉和細胞位置變化可產生三維動畫效果。LSCM 的三維重建廣泛用於各類細胞骨架和形態學分析、染色體分析、細胞程序化死亡的觀察、細胞內細胞質和細胞器的結構變化的分析和探測等方面。

二）靜態結構檢測：原位鑑定細胞或組織內生物大分子、觀察細胞及亞細胞形態結構

1. 細胞原位檢測核酸

用於細胞核定位及其形態學觀察、檢測細胞內DNA 的複制及斷裂情況以及染色體定位觀察。

2. 原位檢測蛋白質、抗體及其他分子

    原位檢測蛋白質、抗體及其他分子

    免疫熒光標記技術

    檢測熒光蛋白

3. 檢測細胞凋亡

檢測細胞凋亡不同時期細胞形態、細胞凋亡相關蛋白

4. 細胞器觀察及測定

探針可以直接跨過死細胞或活細胞膜，選擇性地與特定細胞器結合

5. 檢測細胞融合

6 . 觀察細胞骨架結構

 7. 觀察細胞間縫隙連接通訊

8. 檢測細胞內脂肪

 尼羅紅檢測動物組織中或體外培養細胞內脂滴含量

三）動態觀察：活體細胞或組織功能的實時動態檢測

1. 實時定量測定細胞內鈣的變化

鈣離子濃度測定和比率成像

2. 測定細胞內PH 變化

同一種探針BCECF ，分別用不同激發峰激發得到的熒光比例，探究PH 變化

3. 檢測膜電位的變化

JC-1 低電位下單體存在，發綠色熒光；高電位下J- 聚集體，發紅色熒光，隨電位增加，紅色熒光也增加

4. 檢測細胞內活性氧物種的產生

5. 藥物篩選

v        檢測藥物等跨膜進入組織或細胞過程及定位

v         對藥物、病毒、細菌等熒光標記，檢測是否進入、位置含量、動態過程

6. 檢測熒光共振能量轉移-FRET

GFP 和YFP ，BFP 和GFP 等研究大分子間的相互作用

7 ．囊泡運輸研究

    利用胞吞/ 胞吐探針FM4-64 ，結合激光共聚焦、電鏡、TIRF ，檢測囊泡的運動過程，探討BFA 對胞吞/ 胞吐過程的影響。

8. 檢測熒光漂白恢復

將待測細胞用熒光物質標記，淬滅；低強度激光掃描成箱，非淬滅分子移動，直接反映熒光標記物質及其結合物的運動，因此可用來研究縫隙連接通訊的快慢.

綜上所述，雷射掃描共軛顯微鏡由於其高分辨率、高靈敏度、高放大率等特點，在細胞水平上可作多種功能測量和分析，成為分析細胞學的一項重要研究手段。隨著LSCM 設備和應用技術的不斷完善，它在生物醫學和生命科學領域裡將起到更重要的作用。